知母皂苷AIII抑制人脑胶质瘤增殖生长的机制研究

时间：2017-07-13 15:06

　　[摘要] 考察知母皂苷 AIII抑制人脑胶质瘤 U87MG细胞增殖的作用及机制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中,知母皂苷 AIII组 与模型组相比,显著降低瘤重。知母皂苷 AIII呈剂量依赖性抑制 U87MG细胞的体外增殖;呈剂量依赖性降低 βCatenin,Cyclin D1,Bcl2的蛋白表达,同时升高 p21在蛋白和基因水平的表达;降低 ERK磷酸化水平,抑制 βCatenin的核转移,同时提高 p38和 JNK蛋白的磷酸化水平。联用 JNK抑制剂 SP60125和 p38抑制剂 SB203580后可逆转知母皂苷 AIII处理而提高的 p21和 降低的 βCatenin的蛋白表达。知母皂苷 AIII部分通过干预 MAPK及 Wnt/βCatenin信号通路而抑制脑胶质瘤 U87MG的 增殖。

　　中药知母是百合科植物知母 Anemarhenaas phodeloidesBge的 干 燥 根 茎 ,具 有 滋 阴 润 燥 、清 热 泻 火等功效。其性寒,味苦,归肺、胃、肾经,临床用于外感热 病、骨 蒸 潮 热、肺 热 燥 咳、高 热 烦 渴 等 症 状 [1]。 其 主 要 药 理 活 性 成 分 知 母 皂 苷 在 知 母 根 茎 中的质量分数约为 6%[2]。国内外研究人员发现知 母皂苷 AIII能抑制 ADP诱导的血小板聚集、诱导肿 瘤 细 胞 自 噬 等 [34],近 年 来 对 于 知 母 皂 苷 AIII 抗 肿 瘤 活性的研究日益深入[57],有希望将其开发成一种新 的抗癌类药物。

　　脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的70%。恶性脑胶质瘤是 34岁以下肿瘤患者的第二 位死亡原因,患者平均存活的中位时间是 14个月。 脑胶质瘤多呈侵袭性生长,总体疗效不佳,是神经外 科治疗中最棘手的难治性肿瘤之一[810]。目前尚未 有知母皂苷 AIII抑制脑胶质瘤增殖生长的相关报 道。该文考察知母皂苷 AIII体内外抑制脑胶质瘤增 殖生长的作用并基于 MAPK信号通路和Wnt/βCatenin信号通路考察其机制。

　　1.材料

　　1.1 药物与试剂

　　知母皂苷 AIII、淫羊藿苷II、红 景天苷、原薯蓣皂苷元均购自上海同田生物技术股 份有限公司;人脑恶性胶质瘤细胞株 U87MG购自 美国 ATCC公司;DMEM干粉培养基、胎牛血清购自Gibco公 司 ;二 甲 基 亚 砜 、噻 唑 蓝 购 自 西 格 玛 奥 德 里 奇 (SigmaAldrich)公 司 ;cDNA 逆 转 录 试 剂 盒 、Trizol试剂购自赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific) 公司;RealMasterMix(SYBRGren)试剂盒、蛋白酶 抑制剂和磷酸酶抑制剂 PhosSTOP均购自美国Roche公 司 ;引 物 均 由 生 工 生 物 工 程 (上 海 )有 限 公 司合成。Marker预染蛋白购自 Progema公司;NC膜 购自英国沃特曼 Whatman公司;一抗 βactin,pERK,TERK,pp38,Tp38,pJNK,TJNK,βCate nin购自美国细胞生物技术(CelSignalingTechnolo gy)公 司 ;p21、Cyclin D1 抗 体 、二 抗 山 羊 抗 鼠 、二 抗 山羊抗兔均购自美国 abCAM公司。ECL化学发光 试剂盒购自美国通用公司生命技术科学部门(GE);BCA 蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒 、RIPA 蛋 白 强 裂 解 液 、Bcl2抗体、HDAC1抗体、细胞核蛋白细胞浆蛋白抽 提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;其他试剂 均为分析纯。

　　1.2 仪 器

　　生 物 安 全 柜 (Delta series,Labconco,美 国 );CO2培 养 箱 (HEPA CLAS S10 0,Thermo,美 国 ); 细 胞 计 数 仪 (XDS50 0C,上 海 蔡 康 光 学 仪 器 有 限 公 司 );倒 置 显 微 镜 (IX 71,Olympus,日 本 );QB90 06恒温微孔板快速振荡器(海门市其林贝尔仪器有限 公司);荧光定量 PCR仪(750FastSystem,Aplied Biosystems公司,美国);超声波细胞粉碎机(JY92 2D,宁波新芝生物股份有限公司);低温高速离心机 (EpendorfCentrifuge5810R,德国);电泳仪(Power PacTM HC,BIORAD 公 司 ,美 国 );脱 色 摇 床 (TS8,Kylinbel lLab Instruments,中 国 );凝 胶 成 像 系 统 (TanonNIM2045,上 海 天 能 公 司 );SpectraMAX190酶标仪(MD公司,美国)。

　　2.方法

　　2.1 细 胞 培 养

　　U87MG 细 胞 培 养 于 添 加 了 10% 胎 牛血清的 DMEM培养基中,置于 37°C恒温、5%CO2培养箱中饱和湿度的条件下培养。稳定传 2~3代 后,选择处于对数生长期细胞用于后续实验。

　　2.2 建 立 裸 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型

　　在 裸 鼠 左 上 肢 腋 下缓慢推注注射 02mLU87MG细胞混悬液,含2× 106个 细 胞 。 定 期 观 测 裸 鼠 成 瘤 的 时 间 和 瘤 体 积 大 小 。 肿 瘤 的 体 积 用 游 标 卡 尺 测 量 肿 瘤 的 最 长 径 (a) 及最短径(b),并根据公式 V=ab2/2进行计算。成 瘤后,给予中药单体 1mg·kg-1腹腔注射 14d,取 瘤称重,免疫组化检测 Ki67。

　　2.3 MTT法考察

　　知母皂苷 AIII对 U87MG脑胶质瘤 细 胞 增 殖 能 力 的 影 响 U87MG 细 胞 悬 液 调 节 成 密 度 为 5 × 1 0 4 个 /m L , 每 孔 接 种 1 0 0 μ L 于 9 6 孔 板 中 , 在CO2培养箱中过夜。为考察知母皂苷 AIII对U87MG细胞增殖能力的影响,预试验中设置 24,48,72h时间点,数据差异不大(未显示),最终选择 24 h为 MTT检测时间。知母皂苷 AIII于 125,25,5,10μmol·L-1剂量处理 U87细胞,孵育 24h后,每 孔 加 入 5g· L-1 MTT(1×PBS为 溶 剂 )溶 液 20μL, 继续避光培养 4h,弃上清,每孔加入 150μLDM SO,37°C摇床振摇 5~10min至其充分溶解,于酶 标仪测得在 490nm波长下的吸光度 A,计算用知母 皂苷 AIII不同浓度处理的各组细胞的细胞活性。细 胞活性率=(A给药组 -A空白对照组)/(A对照组 -A空 白 对 照 组 ) ×10 0% 。 每 组 独 立 实 验 重 复 3次 。

　　2.4 QRTPCR考

　　察知母皂苷 AIII对细胞凋亡信号 通路中 p21mRNA表达的影响 为考察知母皂苷 AIII对细胞周期的影响,检测其对细胞周期阻滞蛋白p21的表达的影响,文献报道知母皂苷 AIII诱导白 血 病 细 胞 凋 亡 时 间 为 4 h[1 1] ,预 实 验 中 比 较 了 4,6,24h知母皂苷 AIII诱导 p21基因和蛋白表达变化 (数据未显示),最终确定 4h检测 p21基因表达变 化 ,6 h 检 测 蛋 白 表 达 变 化 。 U87M G 细 胞 贴 壁 过 夜 培养后,更换为新鲜的无血清 DMEM培养液,给药 处 理 组 加 入 知 母 皂 苷 AIII (5,10 μmol· L-1)继 续 培 养 4h,每组加 1mLTrizol按照 Trizol说明书提取步 骤收集各组细胞的总 RNA,读取和计算各组 RNA浓度,加 DEPC水将全部样品的 RNA调整至同一质 量浓度 500mg·L-1。A260/A280在 18~20的样品 进行逆转录。按照 HighCapacity逆转录试剂盒说 明书,20μL逆转录体系的反应条件为:25°C 10 min,37°C 120min,85°C 5min,产物置于 4°C备 用。按照 RealMasterMix(SYBRGren)说明书,以20μL反应体系合成模板 cDNA,进行定量反转录聚 合 酶 链 式 反 应 (QRTPCR)。 引 物 序 列 如 下 :p21 Forward5′TGAGCCGCGACTGTGATG3′;Reverse5′ GTCTCGGTGACAAAGTCGAAGTT3′; βactin For ward 5′CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC3′;Reverse 5′CGGACTCGTCATACTCCTGCT3′,由 生 工 生 物 工 程(上海)有限公司合成。反应条件为:95°C 10 min,50°C 2min,95°C预变性 15s,53°C 1min,扩 增 40个循环。每组样品均做 3个复孔。知母皂苷AIII处理组的相对含量用 2ΔΔCt计算得出。每组独立 实验重复 3次。

　　2.5 Westernblot考察

　　知母皂苷 AIII及抑制剂联用 对信号通路中关键蛋白表达含量的影响 为考察知 母皂苷 AIII对 MAPK信号通路的影响,而蛋白磷酸 化水平随时间变化而变化,最终确定知母皂苷 AIII(5,10μmol·L-1)处理 30min后,收集蛋白检测MAPK主要蛋白的磷酸化水平。细胞分为空白对照 组、抑制剂联用组为抑制剂联用预处理 1h后加入 知母皂苷 AIII(5,10μmol·L-1)、抑制剂联用单独 处理组、知母皂苷 AIII(5,10μmol·L-1)单用组处 理 6h,冰镇 1×PBS清洗,加入磷酸酶抑制剂、蛋白 酶抑制剂和 RIPA强细胞裂解液后收集细胞,超声 细胞粉碎机超声破碎(3次,3s/次),离心机在 4°C以 12 00 0 r· m in - 1 离 心 15 m in 后 取 上 清 。 根 据 细 胞核蛋白细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书,对细胞核 蛋白和浆蛋白进行分离。各组蛋白均用 BCA试剂 盒测定总蛋白浓度。电泳前将每组 15μg的蛋白以4∶1的比例加入 5×loadingbufer,金属浴 95°C 2 m in 后 即 用 1 0 % 或 1 2 % 的 S D S P A G E 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶电泳,用湿转法将蛋白转到 NC膜上后,用 5%脱 脂牛奶或 5%BSA溶液封闭 1h,分别用一抗 βac tin,βCatenin,CyclinD1,p21,Bcl2,pERK,TERK,pp38,Tp38,pJNK,TJNK,4°C孵育过夜,用 TBST洗 膜 5 min,6 次 后 加 入 相 应 二 抗 (1∶1 万 )孵 育 ,TBST洗膜 5min,6次后,ECL显影液显影。每组独 立实验重复 3次。

　　2.6 统 计 分 析

　　本 实 验 所 有 计 量 资 料 均 以 x珋 ± s 表 示,两样本组间比较采用 t检验,P<005为差异具 有统计学意义。

　　3 .结果

　　3.1 知母皂苷 AIII对裸鼠皮下荷瘤模型的影响与模型组比较,知母皂苷 AIII处理组的瘤重呈显著 性降低(P<005)。而淫羊藿苷II、红景天苷、原薯 蓣皂苷元处理组的瘤重有一定的下降趋势,但无显 著性差异。Ki67的表达与肿瘤细胞增殖密 切 相 关 , 临 床 上 K i6 7 作 为 评 价 恶 性 肿 瘤 细 胞 生 长 的 重要指标。与模型组比较,知母皂苷 AIII处理组的Ki67阳性细胞数显著减少(P<005)。其余组与模 型组比较,无显著性差异。

　　3.2 知母皂苷 AIII对 U87MG细胞增殖能力的影响 不同剂量的知母皂苷 AIII(125~10μmol·L-1) 和 人 脑 胶 质 瘤 细 胞 共 孵 育 24 h,知 母 皂 苷 AIII 在25 ~ 10 μ m ol· L - 1 呈 剂 量 依 赖 性 抑 制 人 脑 胶 质 瘤 细胞 U87MG的细胞增殖(P<005)

　　3.3 知母皂苷 AIII对 U87MG细胞中 p21mRNA的 影响 经知母皂苷 AIII处理 4h后,p21基因水平的 表达呈剂量依赖性提高 (P<001)

　　3.4 Westernblot法检测知母皂苷 AIII对 U87MG细胞中 βCatenin,CyclinD1,p21,Bcl2,pERK,T ERK,pp38,Tp38,pJNK,TJNK 蛋 白 水 平 的 影 响 经知母皂苷 AIII处理 6h后,p21的蛋白表达上调 (P<001),与其基因水平的变化一致。而 βCate n in , B c l2 , C y c lin D 1 经 干 预 后 下 调 ( P < 0 0 1 ) 。 经 知 母 皂 苷 A III 处 理 3 0 m in 后 , E R K 蛋 白 磷 酸 化水平显著降低(P<001),而 p38和 JNK蛋白的 磷酸化水平显著升高(P<001)

　　3.5 Western blot法 检 测 联 用 SP60125 和SB203580对知母皂苷 AIII干预 p21和 βCatenin蛋 白水平的影响 细胞分为空白对照组、知母皂苷 AIII处理组(5,10μmol·L-1)、JNK抑制剂 SP600125(2μmol·L-1)和 p38抑制剂 SB203580(20μmol·L-1)联用组、抑制剂联用组和知母皂苷 AIII共同处 理组。抑制剂联用组,与空白对照组相比,不影响p21和 βCatenin在 U87中的蛋白表达;抑制剂联用 预处理细胞 1h后,知母皂苷 AIII继续处理 6h,抑 制剂联用和 AIII 10μmol·L-1共同处理组与 AIII1 0 μ m o l· L - 1 剂 量 单 独 使 用 组 相 比 , p 2 1 的 蛋 白 表 达显著下调,βCatenin显著上调,逆转了 AIII处理后 提 高 p21和 降 低 βCatenin的 蛋 白 变 化 趋 势

　　3.6 Westernblot法检测细胞核和细胞质中对知母 皂苷 AIII干预 βCatenin蛋白水平的影响 经知母 皂苷 AIII处理 6h后,知母皂苷 AIII处理组与空白对 照组共同进行细胞核和细胞质蛋白的分离,检测核 质内 βCatenin蛋白的表达变化。U87MG细胞经 AIII干预后,βCatenin的核蛋白表达显著降低(图 7)。 在 AIII 10μmolL-1剂量处理组中,该组的细胞核内βCatenin的 蛋 白 表 达 相 比 于 空 白 对 照 组 有 显 著 下 降(P<005)。而细胞质中的 βCatenin蛋白表达 与空白对照组相比无显著变化。

　　4、 结果与讨论

　　W nt/βCatenin 信 号 通 路 与 肿 瘤 发 生 等 多 种 疾病 的 病 理 过 程 相 关 ,在 多 个 细 胞 过 程 (分 化 、迁 移 、 极性和增殖)中发挥重要作用。在胶质瘤组织中,WNT1表达比正常脑组织显著提高,并与 CyclinD1的表达显著相关。Kailiang等基于 UCSC癌症基因 数据库分析发现 βCatenin和 CyclinD1在人脑胶质 瘤 细 胞 中 呈 高 表 达 状 态 [12]。 βCatenin作 为 核 转 运 受体,通过与黏附分子相互作用,获得协调核功能和 细胞黏附的属性[13]。熊果酸可通过降低 βCatenin的核转移干预 Wnt/βCatenin信号通路而抑制骨肉 瘤的生长[14]。在本研究中,经知母皂苷 AIII处理后, U87MG细胞中 βCatenin,CyclinD1和 Bcl2的蛋白 表达水平均呈剂量依赖性降低,且 AIII 10μmol·L-1能显著降低 βCatenin的核转移。

　　周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂 p21(也称 为 p21WAF1/CIP1蛋白)是响应于各种刺激促进细 胞周期阻滞的一个因素,在转录调控调节、抑制细胞凋亡、DNA修复中发挥作用[15]。p21由 p53依赖性 和 p53非依赖性的机制来诱导。在 p53非依赖性机 制 中 ,在 有 些 情 况 下 ,p21 具 有 促 进 细 胞 凋 亡 的 作 用[16]。结果显示,知母皂苷 AIII处理后,可于体外 显著提高 U87细胞中 p21在基因和蛋白水平的 表达。

　　丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 家 族 (mitogenactivated proteinkinase,MAPK)是 一 种 广 泛 存 在 于 真 核 生 物 胞 浆 中 高 度 保 守 的 丝 氨 酸 /苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 ,由 细 胞外信号引发细胞核内反应的一条经典通路,影响着 细胞形成、分化、生长、增殖及凋亡等多个生命过程。 研究表明有 4条信号通路存在于 MAPK家族中:ERK(extracel lularsignalregulated kinase)即 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 、JNK (cJun Nterminalkinase)即cJunN端激酶、MAPKp38和 ERK5/BMK1通路。 在 哺 乳 动 物 中,MKK4(MAP2K4)和 MKK7(MAP2K7)磷 酸 化 并 激 活 JNK,而 MKK3(MAP2K3),MKK4,MKK6 和 (MAP2K6)激 活p38[17]。 ERK 是 肿 瘤 细 胞 成 瘾 性 基 因 ,ERK 信 号 通 路与细胞增殖生长密切相关[18]。JNK和 p38调节 细胞存活(如 Bcl2和 Bax),细胞周期(如 P53和CyclinD1)和细胞增殖(如 JUN和 MYC)众多基因 的表达[17]。JNK通路参与知母皂苷 AIII对人黑色 素瘤 A375细胞[19]和白血病 HL60[1]诱导凋亡作 用。本实验结果表明,知母皂苷 AIII呈剂量依赖性 降低 U87MG细胞中 ERK蛋白的磷酸化,同时呈剂 量依赖性提高 p38和 JNK的磷酸化水平。联用 JNK抑制剂 SP60125(2μmol·L-1)和 p38抑制剂SB203580(20μmol·L-1)可逆转知母皂苷 AIII在10μmol·L-1剂量对 p21蛋白的提升作用和对 β Catenin的抑制作用,而抑制剂联用组对 p21和βCatenin的 蛋 白 表 达 的 影 响 ,与 对 照 组 相 比 无 统 计 学差异,结果提示 JNK和 p38信号通路参与知母皂 苷 AIII抑制 U87MG细胞增殖的进程。

　　综上所述,知母皂苷 AIII部分通过 MAPK和Wnt/βCatenin信号通路,提高 p38和 JNK蛋白的磷 酸化水平,抑制 ERK蛋白的磷酸化水平,抑制βCatenin的核转移,提高 p21和抑制 Bcl2,Cyclin D1等抗凋亡蛋白的表达,从而抑制人脑胶质瘤细胞U87MG的体外增殖和体内生长。

　　本文作者：上海中医药大学谭希、上海中医药大学吴伟达、上海中医药大学章丹丹;刊发于2017年 3月 第 42卷第 6期《中国中药杂志》

文章来源：《中国中药杂志》

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